新聞動(dòng)態(tài)
一、化合物基本信息
NHS-LC生物素是一種長鏈、NHS酯活化的生物素化試劑，用于標(biāo)記伯胺（例如蛋白賴氨酸），其膜通透性使其可用于一般細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。磺基NHS-LC生物素是水溶性的、不可切割的，可以對溶液中的抗體、蛋白質(zhì)和任何其他含伯胺的大分子進(jìn)行簡單有效的生物素化試劑，細(xì)胞表面蛋白的特異性標(biāo)記是這些獨(dú)特的水溶性和膜不可滲透試劑的另一個(gè)常見應(yīng)用。
Katsumi團(tuán)隊(duì)2001年發(fā)表《一種利用內(nèi)皮生物素化和抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)的新型血管內(nèi)給藥方法》，此項(xiàng)研究中開發(fā)了一種新型血管內(nèi)給藥系統(tǒng)，將從導(dǎo)管注射的藥物固定到靶組織的血管系統(tǒng)中，活內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞蛋白首先通過生物素化試劑直接生物素化，然后通過親和藥物或使用親和素作為接頭的生物素化藥物結(jié)合。
在最初的實(shí)驗(yàn)中，在體外研究了培養(yǎng)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（BAECs）的生物素化，方法是將生物素化試劑（NHS-LC生物素或磺基-NHS-LC生物素）應(yīng)用于洗滌過的完整BAEC單層上，并表明與細(xì)胞結(jié)合的生物素量取決于所應(yīng)用的生物素試劑的濃度。將細(xì)胞裂解物中生物素的濃度除以裂解物中的蛋白質(zhì)濃度（ng生物素/μg蛋白質(zhì)），以使其值標(biāo)準(zhǔn)化，以應(yīng)對實(shí)驗(yàn)過程中可能的細(xì)胞損失。圖1顯示了生物素化試劑的劑量與細(xì)胞裂解物中校正的生物素濃度之間的關(guān)系。細(xì)胞裂解物中生物素的濃度隨著生物素化試劑劑量的增加而增加。當(dāng)在相同濃度下比較NHS-LC-生物素和磺基NHS-LC生物素時(shí)，NHS-LC生物素的生物素化的細(xì)胞蛋白略多。例如，由1.8mM NHS-LC生物素和磺基NHS-LC生物素制備的細(xì)胞裂解物的生物素濃度分別為0.390和0.304ng每1g蛋白質(zhì)。
在生物素化后，細(xì)胞結(jié)合的生物素隨著時(shí)間的推移而減少，當(dāng)熒光素標(biāo)記的親和素（FITC-avidin）應(yīng)用于生物素化的BAEC單層時(shí)，F(xiàn)ITC-親和素很容易與細(xì)胞結(jié)合。LDH釋放測定顯示磺基NHS-LC生物素對BAEC只有輕微的細(xì)胞毒性，集落形成測定顯示試劑只有輕微的不良反應(yīng)。對正常家兔的腎動(dòng)脈進(jìn)行了體內(nèi)研究，通過導(dǎo)管將NHS-LC生物素溶液注射到一個(gè)腎臟，以生物素化其血管系統(tǒng)，并將載體注射到另一個(gè)腎臟作為對照，然后用鹽水灌注。最后，將FITC-avidin溶液注射到兩個(gè)腎臟，然后在拔出導(dǎo)管后與血液再次融合。在組織學(xué)切片中，生物素化腎臟中超過85%的腎小球被熒光素染色，而對照組中沒有腎小球被染色。在相同手術(shù)后2天采集的腎臟中，大多數(shù)腎小球仍然染色明亮。圖2顯示，在生物素化后，EC中的生物素濃度隨著時(shí)間的推移而降低。當(dāng)使用磺基NHS-LC生物素時(shí)，生物素化蛋白的濃度隨著時(shí)間的推移迅速下降，24小時(shí)后只剩下少量。另一方面，當(dāng)使用NHS-LC-生物素時(shí)時(shí)，在24小時(shí)內(nèi)檢測到大量的生物素分子（60%），在48小時(shí)時(shí)仍能檢測到約40%。根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算出的生物素半衰期分別為38.0小時(shí)（NHS-LC生物素）和10.8小時(shí)（磺基-NHS LC-生物素）。
在用0.18-18mM的磺基NHS-LC生物素和暴露于溶劑中進(jìn)行對照，生物素化24小時(shí)后通過相差顯微鏡檢查了所有的BAEC，所有組的細(xì)胞均為陰性，未顯示任何形態(tài)異常。另一方面，如圖3所示，與低劑量（0、0.18和1.8mM）的生物素化相比，暴露于18mM生物素化試劑的組顯示LDH水平略有增加（克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)，p＜0.02）。
為了研究生物素化抑制劑是否會改變細(xì)胞活性，使用集落形成測定法檢測了它們對細(xì)胞增殖的影響。如圖4所示，BAEC集落的數(shù)量隨著試劑濃度的增加而減少。菌落形成的抑制在1.8-5.4mM時(shí)是明顯的（克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)檢驗(yàn)，p<0.01）。
在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，還研究了抗生物素化藥物是否可以固定在有活力的生物素化EC上。結(jié)果如圖5所示，細(xì)胞裂解物中FITC抗生物素的濃度隨著FITC抗病毒素初始劑量的增加而增加。當(dāng)使用NHS-LC生物素時(shí)，F(xiàn)ITC-avidin的初始劑量與其在細(xì)胞裂解物中的濃度之間的相關(guān)系數(shù)為0.987（p=0.012），而當(dāng)使用磺基NHS-LC-生物素時(shí)為0.977（p=0.026）。
在最終的實(shí)驗(yàn)中，生物素化的腎臟注射抗生物素溶液，然后注射熒光素-生物素溶液。對照腎臟先前沒有生物素化，但接受了與上述相同的抗生物素和熒光素生物素注射，超過80%的腎小球在生物素化的腎臟中染色，但在對照組中沒有染色。這表明生物素化藥物可以通過抗生物素錨定在生物素化血管系統(tǒng)上，而不會被血液沖走。生物素化腎臟的功能未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，這種給藥系統(tǒng)適用于治療某些血管病理狀況，如惡性腫瘤中的微血管增殖，以及在某些靶器官中連續(xù)給藥。
在這項(xiàng)研究中，研究了活內(nèi)皮細(xì)胞的生物素化，以開發(fā)一種將治療藥物遞送到靶區(qū)并將藥物錨定到該區(qū)域的血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。這項(xiàng)研究的兩個(gè)關(guān)鍵要素是導(dǎo)管插入術(shù)在藥物遞送中的應(yīng)用和NHS酯的生物素衍生物在生物素化中的使用。介入放射學(xué)的最新進(jìn)展使得使用血管導(dǎo)管插入術(shù)到達(dá)身體的許多地方成為可能，使用導(dǎo)管插入術(shù)，我們將藥物輸送到作為模型器官的兔腎臟中的血管內(nèi)皮細(xì)胞。一些研究人員之前已經(jīng)報(bào)道了動(dòng)物組織細(xì)胞的生物素化，如紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，使用生物素NHS酯衍生物用于各種目的。NHS酯與蛋白質(zhì)具有高度反應(yīng)性，與NHS酯的化合物可以通過細(xì)胞蛋白質(zhì)固定在活細(xì)胞上。Fuente等人報(bào)道了使用分離的肺對肺內(nèi)皮進(jìn)行生物素化，然后通過血管內(nèi)注射給予生物素化試劑。Katsumi團(tuán)隊(duì)的研究首次將血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物素化用于治療目的。
