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大多數(shù)肽的合成是通過采用Fmoc或Boc保護方法的固相肽合成來實現(xiàn)的，然而在使用Fmoc-OSu時，由于二肽（或三肽）和β-丙氨酰胺雜質(zhì)的形成，在氨基酸中未受保護的N引入Fmoc似乎具有挑戰(zhàn)性。在此介紹一種基于肟的衍生物Fmoc-Amox合成Fmoc-Gly-OH的有效方法，且沒有任何副反應。Fmoc-Amox價格低廉，并且Amox在反應后可以很容易地去除，從而提供不含任何有害雜質(zhì)或污染物（主要是二肽或Amox本身）的純Fmoc-Gly-OH，這一點可以從高效液相色譜和核磁共振得到論證。
1963年，Merrifield描述了一種全新的化學合成概念，市場上有一些藥物的活性成分(API)是TIDES（寡核苷酸和肽治療劑），含有多達30-40個單體，這些單體是使用Merrifield首次描述的固相方法生產(chǎn)的。雖然一開始固相肽合成（SPPS）方法在某種程度上受到了他歐洲同事的質(zhì)疑，但目前此方法已經(jīng)廣泛應用于合成研究及生產(chǎn)。
從命名可以看出，所有氨基酸至少有兩個官能團：一個羧酸和一個氨基。如果氨基酸C末端羧酸的活性被不溶性高分子基團掩蓋、氨基被臨時保護起來，再逐步連續(xù)的參與反應，也包括脫除氨基的保護基團，然后與下一個N被保護的氨基酸進行偶聯(lián)。然而，在三官能團氨基酸的情況下，側(cè)鏈則被永久（或半永久）保護基團所保護。早些年，Merrifield使用芐基 (Bn) 進行長期保護，使用叔丁氧基羰基 (Boc)作為臨時保護基團，但是Boc和Bn都可以在酸性條件下分解：三氟乙酸（TFA）脫Boc、強酸如HF或三氟甲磺酸（TFMSA）水解Bn。在70年代，同樣提出過Boc保護基團的Carpino，通過提出芴基甲氧羰基(Fmoc)作為臨時保護氨基的基團，徹底改變了肽化學領(lǐng)域，即可以使用堿脫除N保護基團，因而與Boc基團正交。此外，歐洲的Sheppard和Atherton，與美國的Chang和 Meienhofer同時開發(fā)了Fmoc/t-Bu方法，反應用TFA溶液處理后釋放出肽。該方法的實施標志著肽合成的“平民化”，因為Boc/Bn方法的使用需要訓練有素的化學工作者和特殊設(shè)備，而通過Fmoc/t-Bu方法，其他生物學實驗室也能夠合成肽。此外，該方法已實現(xiàn)了生產(chǎn)公斤級肽。
最初商業(yè)化的Fmoc-氨基酸是用Schotten-Baumann方法合成：氨基酸與Fmoc-Cl在堿性條件下反應（圖1A）。80年代早期，Ashish小組和Bachem、Goodman指出了大多數(shù)商業(yè)化Fmoc-氨基酸中包含二肽和三肽，這些雜質(zhì)來自Fmoc-Cl的高反應性，它也可以與要保護的氨基酸的羧基反應生成酸酐，酸酐又可以與另一個氨基酸分子的胺末端反應，導致形成二肽。機制如圖1B所示。
圖1 氨基酸的Fmoc保護
A. Fmoc保護機制
B. 在氨基酸保護過程中形成受保護二肽的機制
考慮到即使是很小比例的雜質(zhì)也會導致收率和純度下降，因此雙方共同得出了避免使用 Fmoc-Cl的結(jié)論。由于這些副反應與離去基團的質(zhì)量有關(guān)，Ashish小組建議使用Fmoc-N3，同樣Carpino 和Han在他們的論文中也有提到此觀點。Ashish小組提出了用Fmoc-Cl和疊氮化鈉合成Fmoc-N3，為了避免Fmoc-N3制備和存儲的危險性，現(xiàn)做現(xiàn)用，該方法合成的Fmoc-氨基酸具有較高純度。Verlander等人通過篩選不同的離去基團，建議使用Fmoc-OSU，與此同時，Bolin等人建議使用甲硅烷基化試劑保護羧基。多年后，Barlos等人提出了從Trt-Cl制備Trt-氨基酸的方法，以避免Trt酯類雜質(zhì)的生成。后來，Suresh等人提出在活化鋅粉存在下用Fmoc-Cl制備Fmoc-氨基酸，此方法允許在中性條件下進行。
然而，長期以來最常用的Fmoc-氨基酸合成方法是Fmoc-OSu（或 NHS），當Hlebowicz等人對Fmoc-Cl制備Fmoc-氨基酸提出質(zhì)疑時，該方法也受到了質(zhì)疑。Bachem Europe的研究表明，使用Fmoc-OSu制備的Fmoc-AA-OH中含有Fmoc-β-Ala-OH和Fmoc-β-Ala-AA-OH，這兩個雜質(zhì)是在OSu攻擊一個羰基后通過Lossen重排形成的（圖2）。
圖2 β-丙氨酰胺通過Lossen重排的形成機制
這些發(fā)現(xiàn)再次激發(fā)了開發(fā)新試劑或安全引入Fmoc基團方法的研究熱情。表1列出了用于保護氨基酸的不同F(xiàn)moc衍生物及其用于制備Fmoc-Gly-OH的結(jié)果，雖然這種反應可以用于所有氨基酸的保護，但Gly更明顯，因為它的低位阻有利于高效率的聚合。這些引入Fmoc的衍生物應具有兩個關(guān)鍵特征：（i）無特殊高反應性，避免低聚肽的形成；（ii）離去基團通常是被氨基酸取代的羥基化合物，在處理過程中相對更容易去除。因此，Ashish小組首先提出了 Fmoc-2-巰基苯并咪唑，它合成的Fmoc衍生物中低聚肽較少（表1，#4）。然而，反應中釋放的副產(chǎn)物2-MBT溶解度差，需要用有機溶劑洗滌才能完全去除，而Fmoc-氨基酸在有機溶劑中也有一定的溶解度，因此不利于最終產(chǎn)率。Verlander等人遇到了類似的問題，當使用（多）氯苯基衍生物時，有機溶劑醇污染了最終產(chǎn)品，導致總收率低（4-30%）。
其他琥珀酰亞胺的衍生物，例如鄰苯二甲酰亞胺、降冰片烯基（它是由降冰片烯衍生的自由基）和相應的螺環(huán)類似物、六元衍生物等，也進行了分析，但并不具有顯著優(yōu)勢（表1，#5-7）。同時，當降冰片烯基與EDC結(jié)合用于水中的固相肽合成 (SPPS) 時，檢測到了β-丙氨酸的形成。為了克服使用琥珀酰亞胺衍生物導致β-丙氨酰胺殘基嵌入問題，Najera等人提出了一種聚合物形式的試劑，最終β-丙氨酰胺污染物是固定在聚合物載體上的，但這種方法限制了制備少量保護氨基酸的使用。
通常與碳二亞胺偶聯(lián)化合物例如五氟苯基(Pfp)或苯并三唑(Bt)一起使用的其他活性物質(zhì)，雖然這些試劑價格相對偏高(Pfp)或易爆(Bt)（表1、#8、9），但產(chǎn)率很高，有些實驗室甚至研究了Fmoc-三嗪衍生物（表1，#10）作為一種合成Fmoc-氨基酸的方法。對于使用純水溶液引入Fmoc的方法，已使用Fmoc-苯基二甲基锍甲基硫酸鹽 (Fmoc-ODsp)，但未研究是否有二肽的形成（表1，#11）。
為了克服肽結(jié)構(gòu)單元合成中的最大挑戰(zhàn)之一，即在氨基酸保護過程中不希望形成二肽和三肽，已經(jīng)深入研究了大量Fmoc離去基團的方法。盡管少量試劑有還不錯的結(jié)果，但基本沒有一種有潛力能應用于工業(yè)化生產(chǎn)。在此方面，基于常用的碳二亞胺添加劑肟的結(jié)構(gòu)，提出了Fmoc離去基團衍生物Fmoc-Amox。Fmoc-Amox已用于保護極易產(chǎn)生副反應的H-Gly-OH，有很高的收率 (93%) ，并且完全沒有Fmoc-二肽形式的副產(chǎn)物產(chǎn)生，這從 HPLC和NMR分析中得到印證。此外，Amox衍生物將來或許可用于引入其他保護基團，例如pNZ、Alloc和Boc。
Ashish小組認為Oxyma是比碳二亞胺更優(yōu)秀的添加劑，Oxyma反應性強，在肽的工業(yè)化生產(chǎn)中的應用越來越廣泛。小組也研究了其他反應性較低的肟衍生物來引入Fmoc基團，從第一次篩選（表1，#12-16）中，包括2-羥基吡啶N-氧化物(HOPO)，Oxyma衍生物（表1，#12）由于其高反應性而得到含量較多的二肽，然后是HOPO（表1，#16）。氰基吡啶肟也是較好的添加劑（表1，#15），但其價格昂貴，而且很難從反應中去除。第二次篩選得到的二肽形成量總體較少（表1，#17-20），因此選擇氰基酰胺衍生物（Amox）（表1，#20）作為替代 HOSu 以引入Fmoc。Fmoc-Amox價格適宜，并且在反應后可以很容易地去除，這與MBT的情況不同，Amox 在水中的溶解度為0.9 M，這確保了它不會污染最終的Fmoc-氨基酸（表1，#4）。
在Fmoc-二肽形成方面，H-Gly-OH被證明是評估Fmoc-Amox性能的最佳試劑，因為其低空間位阻有利于高比例的寡聚化。使用1克和40克兩種平行實驗制備Fmoc-Gly-OH結(jié)果接近，反應過程描述如下：將Fmoc-Amox的丙酮溶液緩慢加入到攪拌的H-Gly-OH和碳酸鈉水溶液中，通過連續(xù)分批添加碳酸鈉將反應混合物的pH值保持在9-10。通過TLC以及pH穩(wěn)定性監(jiān)測反應(pH的降低作為發(fā)生反應的標志)。反應完成后(4小時)，除去溶劑，剩余的水層用DCM洗滌，然后加入1N HCl(直到pH＜2)，得到灰白色沉淀，然后過濾沉淀物并使用乙酸乙酯和正己烷(93％)重結(jié)晶，HPLC檢測Fmoc-Gly-OH的純度非常好。由于通過固相技術(shù)制備的Fmoc-Gly-Gly-OH會與Fmoc-Gly-OH一起被洗脫出來，表明形成的二肽雜質(zhì)是難去除的，如圖 3所示，色譜圖中沒有觀察到二肽的痕跡（圖3）。此外，1H NMR 未顯示Amox存在任何污染（圖4），這清楚地表明Amox在合成Fmoc氨基酸方面有很大的優(yōu)勢。
圖3 (A) Fmoc-Gly-OH和一同洗脫的Fmoc-Gly-Gly-OH的HPLC色譜圖
(B) Fmoc-Gly-OH的HPLC色譜圖
圖4 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Amox和Amox的1H和13C NMR比較
在這些結(jié)果的推動下，使用上述方法制備了Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Val-OH（各10 g小試）（圖5和6）。最終產(chǎn)物的純度通過HPLC和NMR確認，沒有顯示二肽的微量形成。還研究了溶劑在后處理過程中的重要性，將所得產(chǎn)物溶解在DCM中并使用蒸餾水萃取，DCM后處理有助于去除微量的Amox，從而產(chǎn)生經(jīng)NMR證實的純品（圖 7）。
圖5 (I)A. Fmoc-Phe-OH與Fmoc-Phe-Phe-OH一同洗脫的HPLC色譜圖
B. Fmoc-Phe-OH的 HPLC色譜圖
(II) Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Amox和Amox的1H和13C NMR比較
圖6 (I) A. Fmoc-Val-OH與Fmoc-Val-Val-OH一同洗脫的HPLC色譜圖
B. Fmoc-Val-OH的 HPLC色譜圖
(II) Fmoc-Val-OH、Fmoc-Amox和Amox的1H和13C NMR比較
圖7 使用乙酸乙酯和DCM萃取Fmoc-Phe-OH的后處理比較
這些結(jié)果清楚地表明了Fmoc-Amox在合成最容易產(chǎn)生副反應的Fmoc-氨基酸方面具有很大的優(yōu)越性。
Fmoc-氨基酸的合成實例：
1、將甘氨酸（131.34mmol）、碳酸鈉（106mmol）加到純化水中，滴加Fmoc-Amox（119.4mmol）的丙酮溶液，保證反應液pH始終保持在9-10。待TLC檢測Fmoc-Amox反應完全，將反應液濃縮去除丙酮后用二氯甲烷萃取除雜，水相用1N HCl調(diào)酸，大量白色固體析出，過濾，濾餅用純化水洗三遍。收集固體用乙酸乙酯/正己烷重結(jié)晶，得到高純度的Fmoc-甘氨酸。
2、將苯丙氨酸或纈氨酸（33mmol）、碳酸鈉（75mmol）加到純化水中，滴加Fmoc-Amox（30mmol）的丙酮溶液，保證反應液pH始終保持在9-10。待TLC檢測Fmoc-Amox反應完全，將反應液濃縮去除丙酮后用二氯甲烷萃取除雜，水相用1N HCl調(diào)酸，大量白色固體析出，過濾，濾餅用純化水洗三遍。收集固體用乙酸乙酯/正己烷重結(jié)晶，得到高純度的Fmoc-苯丙氨酸或Fmoc-纈氨酸。
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